基于CRISPR/CAS9的基因敲除敲入服務 二維碼
蘇州東嶺生物技術有限公司（東嶺生物，DL Biotech）創建于2016年，擁有在干細胞和腫瘤免疫研究領域深耕數十年的技術團隊，企業愿景是成為國內領先的免疫治療藥物研發技術服務供應商，同時研發生產關鍵試劑替代進口。經過4年多的努力，公司已建成干細胞/免疫細胞系統鑒定檢測平臺和基因編輯平臺，可為免疫治療藥物研發機構提供定制服務方案及工具產品。 CRISPR/Cas9是一種在特定目標位置切割DNA的工具，Cas9蛋白可在sgRNA的引導下對特定基因進行剪切，從而達到基因敲除、敲入以及修飾、調控等目的。 敲除：與常規的shRNA敲低不同，CRISPR/CAS9和sgRNA可特異性的在基因組水平造成堿基的缺失或插入（INDEL），造成原有基因表達框的破壞，造成靶基因蛋白水平的完全敲除（圖1左）。 敲入：與常規病毒介導的過表達不同，CRISPR/CAS9和sgRNA在特定基因組位點切割后，可在帶有同源臂的修復模板引導下，將待敲入的基因插入到目的位點，不同于病毒介導的隨機整合（圖1右）。
圖1：CRISPR/CAS9工作示意圖 圖片出引自：Front. Plant Sci., 24 May 2016 東嶺提供CRISPR/CAS9敲除和敲入環節所需的載體和病毒，亦可為客戶提供一站式服務，周期及項目見下表：
注：定制服務包括敲入服務、穩定細胞株構建。 其他服務項目：
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圖2：T7E1檢測基因組水平功能驗證。將針對靶基因設計的5條sgRNA構建到sgRNA病毒載體，通過順轉導入CAS9穩轉工具細胞株，可到＞70%轉染效率。轉染3天后收集細胞基因組進行T7E1檢測sgRNA切割效率，可見sgRNA 1/ 2/ 3/ 5均有較高切割效率。
圖3：成功構建基因敲除單克隆細胞株。將sgRNA1多克隆細胞進行單克隆鋪板，擴增后的單克隆收集基因組通過PCR獲得目的基因片段，進行測序發現克隆1/2分別有單個堿基和多個堿基的缺失突變，靶基因敲除單克隆細胞株構建成功。 東嶺團隊經過長期積累，已改造獲得多種CRISPR/CAS9及sgRNA相關載體用于敲除和敲入，以及spCAS9穩轉工具細胞株供客戶直接使用，具體信息如下表：
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